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花生过敏原Ara H1(Arah1)ELISA试剂盒
简介
5α-还原酶(Arah1) 是花生中最主要的过敏原蛋白，占花生总蛋白的12%-16%，分子量为63.5 kDa，属于豌豆球蛋白类，具有高度的致敏性和热稳定性。Ara H1是花生过敏患者血清中识别率最高的过敏原蛋白，超过90%的花生过敏患者对其产生特异性IgE反应。Ara H1的致敏性主要与其IgE结合位点有关，这些位点通常位于蛋白质的疏水性残基区域。Ara H1的致敏性主要与其IgE结合位点有关，这些位点通常位于蛋白质的疏水性残基区域。研究表明，Ara H1可以通过可重复的荧光法形成稳定的三聚体结构，这种结构有助于其与IgE结合。
本试剂盒Arah1免疫测定是一种三步法固相夹心ELISA，用于测量细胞培养上清液、血清和血浆中的Arah1。试剂盒包含大肠杆菌表达重组Arah1和针对重组蛋白产生的抗体。使用天然Arah1获得的结果显示出与使用重组标准品获得的标准曲线平行的线性曲线。这些结果表明，该试剂盒可用于测定天然Arah1的相对质量值。
检测原理
试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物Arah1，孵育清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色液后，若样本中有待测物则显蓝色，则加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中Arah1的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
试剂准备
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热?晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从640ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至32ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的32ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将32ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为：32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。
一抗工作液配置
使用前10分钟，用1×稀释液将100×一抗工作液稀释成1×一抗工作液，根据所需用量配置。
酶标二抗工作液配置
使用前10分钟，用1×稀释液将100×酶标二抗稀释成1×酶标抗体工作液，根据所需用量配置。
备 注：如样本中待测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数 (建议：将待测样本用样品稀释液最低稀释1倍，在正式实验之前做预实验，以确定具体稀释倍数) ；标准品母液及100×酶标二抗溶液根据实验所需酶标板孔数吸取一定量配制工作液，剩余溶液应放回-20℃储存，且避免反复冻融。（若实验在1-2周内做完，标准品母液及100×酶标抗体置于2-8℃保存；若实验为长时间跨度实验，建议将标准品母液及100×酶标抗体置于-20℃保存，以保证实验结果的稳定性）
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
精密度
批内精密度 ：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。
批内变异系数 CV%小于10%。
批间精密度 ：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。
批间变异系数 CV%小于15%。
回收率
样本回收率：80% - 120%
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.25ng/mL。
线性关系
分别在选取的4份健康血清、血浆和细胞培养上清中加入高浓度Arah1，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。
本ELISA试剂盒实验计算和曲线图，请您下载产品说明书(供参考），本试剂盒仅供科研使用，不得用于临床诊断和治疗。
