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犬瘟热病毒探针法qRT-PCR试剂盒
产品及特点
犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus，CDV）属于副粘病毒科、麻疹病毒属，是一种单链RNA病毒，主要侵犯狗科、鼬科动物，能够引起犬瘟热病。该病引起的一种高度接触性传染�。拘郧�。犬瘟热症状初期狗发高热，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水样分泌物，打喷嚏，有腹泻。在以后2-14天内再次出现体温升高，咳嗽，有脓性鼻涕、脓性眼屎这时候已经是犬瘟中期了。同时继发胃肠道疾�。煌�、拉�。秤暇�。精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟热发病后期就会出现典型的神经症状，口吐白沫，抽搐，死亡率可高达80%以上，因此快速灵敏诊断犬瘟热病毒具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测犬瘟热病毒的试剂盒，它具有下列特点：
产品及特点
犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus，CDV）属于副粘病毒科、麻疹病毒属，是一种单链RNA病毒，主要侵犯狗科、鼬科动物，能够引起犬瘟热病。该病引起的一种高度接触性传染�。拘郧�。犬瘟热症状初期狗发高热，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水样分泌物，打喷嚏，有腹泻。在以后2-14天内再次出现体温升高，咳嗽，有脓性鼻涕、脓性眼屎这时候已经是犬瘟中期了。同时继发胃肠道疾�。煌�、拉�。秤暇�。精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟热发病后期就会出现典型的神经症状，口吐白沫，抽搐，死亡率可高达80%以上，因此快速灵敏诊断犬瘟热病毒具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测犬瘟热病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据犬瘟热病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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探针法qRT-PCR缓冲液 |
500μL |
0.5mL蓝盖管 |
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探针法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL红盖管 |
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荧光PCR专用模板稀释液 |
1mL |
1.5mL绿盖管 |
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犬瘟热病毒qRT-PCR引物-探针干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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犬瘟热病毒qRT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL) |
50μL |
0.5mL黄盖管 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165 μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀释标准曲线样品以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。如果需要RNA阳性样品，需要另外订购。
稀释标准曲线样品以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。如果需要RNA阳性样品，需要另外订购。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3. 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
样品RNA的制备
7. 如果有N个样品，设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
Probe qRT-PCR反应20μL体系，在样品制备室进行
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
数据处理
1. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
2. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
自备试剂
样品RNA
样品RNA
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年
低温运输，-20℃保存，有效期2年
