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021-54845833/15800441009
产品及特点
CHO细胞，即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary），其逆转录酶实验为阳性，具有致瘤的风险。这表明CHO细胞可能携带有逆转录病毒前病毒，其基因整合入受者基因组可能导致感染；如果存在病毒或传代细胞基质中的致癌基因，则可能具有引发肿瘤的潜在风险。因此，中国药典2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100 pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10 ng/剂，同时也规定，重组乙型肝炎疫苗中CHO细胞残留DNA不得超过10 pg/剂。由于宿主细胞DNA残留量的控制是生物制品质量控制中非常重要的环节，因此本公司基于荧光定量PCR技术，开发了专门用于检测样品中CHO细胞基因组DNA残留的本产品，它具有下列特点：
CHO细胞，即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary），其逆转录酶实验为阳性，具有致瘤的风险。这表明CHO细胞可能携带有逆转录病毒前病毒，其基因整合入受者基因组可能导致感染；如果存在病毒或传代细胞基质中的致癌基因，则可能具有引发肿瘤的潜在风险。因此，中国药典2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100 pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10 ng/剂，同时也规定，重组乙型肝炎疫苗中CHO细胞残留DNA不得超过10 pg/剂。由于宿主细胞DNA残留量的控制是生物制品质量控制中非常重要的环节，因此本公司基于荧光定量PCR技术，开发了专门用于检测样品中CHO细胞基因组DNA残留的本产品，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到 0.01 pg/μL。
3. 特异性高，引物和探针是根据CHO细胞DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
4. 既用于定性检测，又用于定量检测。定量检测时线性范围至少为5个数量级。
5.本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
6. 本产品只能用于科研。
规格及成分
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成分 |
规格 |
包装 |
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2×探针法qPCR MasterMix |
625μL |
1.5mL本色管 |
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CHO细胞基因组DNA标准品（1E4 pg/μL） |
250μL |
0.5mL绿色盖 |
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CHO细胞基因组正向引物干粉 |
50次 |
0.5mL白色盖 |
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CHO细胞基因组反向引物干粉 |
50次 |
0.5mL蓝色盖 |
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CHO细胞基因组探针干粉 |
50次 |
0.5mL棕色盖 |
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使用手册 |
1份 |
无 |
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本产品采用五孔盒包装 |
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注 意：引物和探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入138 μL的超纯水充分混匀后得到的浓度分别为10 μM再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
按自选方法进行核酸纯化本试剂盒不相关试剂
按自选方法进行核酸纯化本试剂盒不相关试剂
制备标准曲线样本本试剂盒不相关试剂
1. 标记5个离心管，分别为5、4、3、2、1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头（下同）。
3. 在5号管中加入5 μL 1E4 pg/μL的CHO细胞基因组DNA标准品，
4. 充分震荡混匀1分钟，得到1E3 pg /μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1E3 pg/μL的CHO细胞基因组DNA标准品(上步稀释所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1E2 pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 换枪头，在3号管中加入5 μL 1E2 pg/μL的CHO细胞基因组DNA标准品(上步所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1E1 pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
7. 依次重复上面的操作得到5个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
Probe qPCR反应（25 μL体系，在样品制备室进行)
8. 配制不含DNA模板的PCR反应混合液。如果有N个待测样本，做三次重复，做一个无模板阴性对照，做5个梯度的标准曲线样板，每个PCR反应体系为25 mL，则按下表配制PCR mix：
9. 于96孔反应板每个反应管中分别加上步制备的PCR混合液20 μL，再在阴性对照管中加入水5 μL、在3N个样本管中加入N个DNA样本各5 μL（每个三次重复）、在5个标准曲线管中加入5个稀释度的DNA标准品（来于第二步）各5 μL。在一个管中加水25 μL为背景对照。
10. 反应板覆盖光学盖膜后，离心去除气泡。
11. 将反应板放置在荧光定量PCR仪中运行反应，设定如下参数。阶段1：95℃，10分钟。阶段2：95℃，15秒，60℃ 1分钟，重复40个循环。注：PCR反应体系及反应条件可按照具体使用的仪器及试剂进行相应的调整，实验应在符合检测要求的洁净条件下进行，排除核酸和核酸酶的污染。
数据处理
1. 取第3到15次循环的荧光强度均值加10倍标准差，或采用阴性对照荧光值的高点作为荧光阀值。
2. 以至少5个连续标准品溶液浓度点生成标准曲线，R2值应≥0.98，斜率应在-3.1至-3.8范围内。
3. 标准品液浓度低点的Ct值，不得高于39。
4. 阴性对照组若有Ct值时，不得低于标准品溶液浓度低点的Ct值:
5. 每组加标样品的回收率应在50%~150%之间，RSD≤30%。
6. 适当情况下，可剔除第一个或者第六个点，以连续5个标准品溶液浓度点生成标准曲线，系统适用性仍应满足以上条件。
7. 以标准品溶液浓度的对数值对其相应的Ct值作直线回归，求得直线回归方程，供试品溶液的Ct值代入直线回归方程，求出供试品中 DNA残留量。
自备试剂
荧光PCR专用模板稀释液
荧光PCR专用模板稀释液
运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年
低温运输，-20℃保存，有效期2年
