产品及特点

耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE）又名万古霉素抗药性肠球菌，是肠球菌属下的一种细菌，有着对万古霉素这种抗生素的抗药性。肠球菌是一种移生在肠道的革兰氏阳性球菌，故名肠球菌。在十九世纪末发现，早期归为链球菌属。在肠球菌属中，对人类有着病原性的有粪肠球菌（Enterococcus faecalis）及屎肠球菌（Enterococcus faecium）。而所有屎肠球菌更是有着抗药性的，亦即所有屎肠球菌都是VRE。肠球菌属的细菌主要是在肠内，亦可以在人类的消化道及尿道内发现。VRE特别对免疫系统受损的人有危险性，但是它令健康的人受感染则较少见。一般来说可以引起心内膜炎、败血病及尿道感染等病症。虽然相信有很大比例的鸡只带有VRE，但常见出现接触的地方仍是在医院（院内感染）。因此快速检测耐万古霉素肠球菌vanA/vanB具有重要的意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测耐万古霉素肠球菌vanA/vanB的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据耐万古霉素肠球菌vanA/vanB DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。

5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.两个探针分别用FAM和HEX标记，检测和分型同时完成。

7.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

8. 产品只能用于科研。

规格及成分

成分	规格	包装
2×Probe qPCR MasterMix	0.5mL	0.5mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液	1mL	1.5mL绿盖管
耐万古霉素肠球菌vanA/vanB qPCR引物-探针干粉	50次	1.5mL棕色管
耐万古霉素肠球菌vanA qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)	50μL	0.5mL黄盖管
耐万古霉素肠球菌vanB qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)	50μL	0.5mL白盖管
使用手册	1份	无
本产品采用五孔盒包装
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

使用方法

稀释耐万古霉素肠球菌vanA检测标准曲线样品以阳性对照10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
1. 标记6个离心管，分别为A6，A5，A4，A3，A2，A1。
2. 在A1-A6号管中各加入45μL荧光PCR专用模板稀释液。
3. 在A6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线PC样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在A5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在A4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用
6. 重复上面的操作得到A1-A6共六个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

稀释耐万古霉素肠球菌vanB检测标准曲线样品

7. 操作同上，只是使用耐万古霉素肠球菌vanB的PC作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是B1-B6。

样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，设置N+3个提�。喑龅囊桓鍪悄屯蚬琶顾爻η蚓鷙anA的PC（样品制备阳性对照），一个是耐万古霉素肠球菌vanB的PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL第一步和第二步所得的4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此分别作为两个PC。另外用水作为NC，水的总体积需要跟样本制备试剂盒所要求的样本体积一样。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

Probe qPCR反应20μL体系，在样品制备室进行

10. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+3+1+6+6个PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于耐万古霉素肠球菌vanA的标准曲线，另外6个用于耐万古霉素肠球菌vanB的标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+3+3个PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于耐万古霉素肠球菌vanA PCR阳性对照，1个用于耐万古霉素肠球菌vanB PCR阳性对照（直接用第一步和第二步所得的两个4号稀释液作为模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

数据处理

1. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。

2. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。

3. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照（FAM通道）和（HEX通道）的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

4. 对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照的Ct必须大于35，或者没有Ct值。阳性对照的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于35则为耐万古霉素肠球菌vanA阴性，如果小于或等于35则为耐万古霉素肠球菌vanA阳性。如果其HEX通道的Ct大于35则为耐万古霉素肠球菌vanB阴性

自备试剂
样品DNA

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期2年

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耐万古霉素肠球菌vanAvanB双重探针法qPCR试剂盒说明书
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