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猪基质金属蛋白酶3(MMP3)ELISA试剂盒
简介
基质金属蛋白酶3(MMP-3)也被称为Stromelysin-1，是一种酶。基质金属蛋白酶（MMP）家族的蛋白质参与细胞外基质蛋白的分解和正常生理过程中的组织重塑，如胚胎发育和生殖，以及疾病过程，如关节炎和肿瘤转移。大多数MMPs是以非活性原蛋白的形式分泌的，当被细胞外蛋白酶裂解时被激活。MMP-3酶可降解II、III、IV、IX和X型胶原蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白。此外，它还可激活其他MMPs，如MMP-1、MMP-7和MMP-9，使MMP-3在结缔组织重塑中至关重要。MMP3除了在细胞外空间的经典作用外，它还可以进入细胞核并控制转录。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术 :将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物MMP3，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中MMP3的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热?晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从6μg/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至300ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的300ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将300ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为: 300ng/mL、 150ng/mL、 75ng/mL、 37.5ng/mL、 18.75ng/mL、 9.375ng/mL、 4.69ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。
抗体工作液配置
使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。
备 注：如待测样本中MMP3度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据
标准品浓度(ng/mL)
300
150
75
37.5
18.75
9.375
4.69
0
OD值
2.532
1.672
1.069
0.735
0.396
0.292
0.157
0.078
校正OD值
2.454
1.594
0.991
0.657
0.318
0.214
0.079
0
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。
下图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果
重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为2.35ng/mL。
特异性
该试剂盒测定可识别重组猪MMP3。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。
使用ELISA试剂盒之前，请您必须完整阅读说明书，本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断和治疗。
