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021-54845833/15800441009
人外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(ENPP2)ELISA试剂盒
简介
外自分泌运动因子（ATX），也被称为外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2 (ENPP2或 NPP2)，是由ENPP2基因编码的酶，是一种分泌酶，对于生成脂质信号分子溶血磷脂酸(LPA) 很重要，它具有溶血磷脂酶D活性，可将溶血磷脂酰 胆碱转化为LPA，它最初被确定为一种肿瘤细胞运动刺激因子，后来它被证 明是LPA（通过溶血磷脂受体发出信号），这是由它催化的反应的脂质产物，它负责其对细胞增殖的影响，该基因编码的蛋白质起磷酸二酯酶的作用，它被分泌并进一步加工以形成具有生物活性的形式，已经鉴定了几种可变剪接 的转录变体，它能够切割三磷酸核苷酸的α和β位之间的磷酸二酯键，作为产 生焦磷酸的外核苷酸磷酸二酯酶，与ENPP家族的大多数成员一样，重要的是它还充当磷脂酶，催化去除各种溶脂的头部基团，它的生理功能是在细胞外液中产生信号脂质溶血磷脂酸(LPA)，LPA 引起生长因子样反应，包括刺 激细胞增殖和趋化性，该基因产物刺激肿瘤细胞的运动，具有血管生成特性， 并且其表达在几种肿瘤中上调，此外，它和 LPA 与许多炎症驱动的疾病有关， 例如哮喘和关节炎，从生理学上讲，LPA 有助于促进对组织损伤的伤口愈合反应，在正常情况下，LPA 负调控它转录，但在伤口修复的情况下，细胞因子诱导它表达以增加整体LPA 浓度。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术 :将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物ENPP2，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中ENPP2的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热?晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从120ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至6000pg/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的6000pg/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将6000pg/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为: 6000pg/mL、 3000pg/mL、 1500pg/mL、 750pg/mL、 375pg/mL、 187.5pg/mL、 93.75pg/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0pg/mL)。
抗体工作液配置
使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。
备 注：如待测样本中ENPP2浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据
标准品浓度(pg/mL)
6000
3000
1500
750
375
187.5
93.75
0
OD值
2.467
1.624
1.091
0.632
0.508
0.268
0.136
0.08
校正OD值
2.387
1.544
1.011
0.552
0.428
0.188
0.056
0
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。
下图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果
重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为46.88pg/mL。
特异性
该试剂盒测定可识别重组人ENPP2。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。
使用ELISA试剂盒之前，请您必须完整阅读说明书，本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断和治疗。
